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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using

发布时间:2018-11-22

  电允许在一个空间和时间控制在发展中国家的中枢神经系统(CNS)的方式进行快速的基因传递。在这里,我们描述了一种高适应的在子宫内电的协议,可用于提供成多个胚胎中枢神经系统领域,包括端脑,间脑和视网膜的表达结构。

  操纵基因表达的能力是现代实验胚胎学的基石,从而澄清了多种发展途径。几个功能强大和完善的转基因技术操纵在小鼠的基因表达水平,从而损俱损,增益功能模型的生成。然而,转基因小鼠的一代,是既费钱又费时。因此,基因操作的替代方法得到了广泛的追捧。电是在子宫内的基因传递到活老鼠胚胎1,2,我们已经成功地适应了3,4方法。它主要是在OVO电通常使用的技术在鸡5,成功的基础上。简单地说,DNA注入开放心室发育中的大脑和应用的电气目前形成细胞膜中的瞬态毛孔成因,允许进入细胞内的DNA吸收。在我们的手中,胚胎可有效电穿孔早期胚胎一天(五)11.5,而针对年轻的胚胎将需要超声引导下的显微注射的协议,如前面描述6。相反,E15.5,是最新的阶段,我们可以很容易地electroporate,由于顶叶和额骨分化,阻碍微量注射入脑的发病。相比之下,视网膜是通过胚胎发育的结束访问。整个胚胎或产后早期胚胎可以在任何时间点收集。注射记者构造有利于转染细胞的鉴定。

  迄今为止,在子宫内的电已被最广泛使用的新皮层发展1,2,3,4的分析。最近的研究有针对性的胚胎视网膜7,8,9和10,11,12丘脑。在这里,我们提出了一个在子宫内电协议,可以很容易地适应目标的胚胎中枢神经系统的不同域的修改。我们提供的证据表明,使用这种技术,我们可以针对胚胎的端脑,间脑和视网膜。代表性的成果是,首先使用这种技术的引入侧脑室DNA的表达结构,使我们能够监测胚胎端脑祖细胞成熟,分化和迁移。我们还表明,这种技术可用于靶DNA周围的3路心室间脑领土,允许分化成间脑核神经元被监视的迁徙路线。最后,我们证明的micromanipulators使用,使我们能够准确地引入小目标的地区,包括视网膜下腔的DNA结构,让我们来分析视网膜发育操纵基因表达的影响。

  设置手术区,如图所示。 1A,A“。设置的关键组件包括微量的Eppendorf Femtojet,Narishige显微持针器,徕卡steromicroscope,光纤照明系统,ECM的830方波电极电穿孔系统,电热垫和异氟醚麻醉蒸发器。

  使用超声外科手术工具Metriclean2低发泡的解决方案与Bransonic超声波清洗机清洗所有的工具。通过高压灭菌消毒的工具。消毒工具,然后存放在Germex。

  将动物里面的小(12厘米x 20厘米),麻醉室。使用喷雾器,提供5%的异氟醚麻醉和氧气在1L/min时(图1A,A“)。值得注意的是,重要的是要收集异氟醚废气清除系统。

  孕鼠在它的后面放置在一个加热垫(37℃)之上。加热垫是先用70%乙醇擦拭消毒,然后消毒,lintless纱布覆盖。使用呼吸器管和面罩仪器提供异氟醚(2.25%)在手术过程中。

  监控整个手术深和定期的呼吸的动物。动物不应该喘气,呼吸浅或迅速。浅,呼吸急促,可能是浅麻醉的标志,并应增加异氟醚的流动。如果动物开始喘息,降低异氟醚的流动。在一个呼吸骤停的情况下,关闭异氟醚关闭,并增加氧流量,直至动物复苏。重新启动在低浓度的异氟醚。

  用消毒棉签拭子,蔓延到腹部的脱毛霜厚层(即奈尔)。在坚定的笔触,确保underfur是完全包覆。留在一个三分钟的平均的间歇性脱毛干净,用无菌棉签,检查。湿一个无菌纱布,用无菌水,抹在腹部,直到所有的痕迹都不见了。重复与洗必泰(即Stanhexidine)皮肤清洁,多饮水。干燥与干净,无菌纱布腹部。

  更多的无菌水(即Stanhexidine)遵循一个洗必泰消毒切口部位。干燥与干净,无菌纱布腹部。重复此步骤,使用70%乙醇和新鲜,消毒棉签。

  为了揭露子宫角,首先找到白线作为中线的皮肤下隐隐线。使用镊子,拔离腹壁皮肤切一小,从中期腹部向下与皮肤剪刀(约1厘米的长度)的直切口。

  认真掌握之间的第一次和第二次的可见胚胎的子宫和拉胚胎上的纱布。取出子宫角两侧,放置在无菌纱布上,数胚胎数,并指出任何再吸收或“不健康”(如车身尺寸较小)胚胎。用生理盐水湿子宫角,并仔细地返回到腹部子宫的一半。

  要加载针,巴斯德吸液管拉至下一个火焰的直径缩小。甲口片连接到加载吸管制订〜10μL3mg/ml内毒素的DNA混合,用0.01%甲基绿(注:绿色染料甲基允许DNA注射到可视化)。充满针,然后装在一个显微的立场,并连接到Femtojet喷油。

  最接近卵巢的胚胎开始,圆形钳轻轻转动蜕膜内的胚胎,使定位“面对面”,使注射发生在一个喙尾鳍方向。光纤光纤照明光源是用来帮助胚胎的大脑,这是由延髓地区的大型横向脑室(图1B,B“)两侧可视化的中线。

  胚胎是使用圆形钳的位置举行。针的上方,使子宫进入大脑的角度约45度。使用的显微操纵器,和一个快速和稳定的的议案,针尖插入子宫壁,进入胚胎的侧脑室。针对侧脑室,第三脑室或目标端脑,间脑和视网膜,视网膜下腔分别注射。请注意,在早期的DNA

  按下脚踏板,注入内毒素的DNA(1-3μL),使用的Eppendorf Femtojet微量。一个成功的注射甲基绿色染料蔓延整个胚胎脑室很容易可视化。然后将针慢慢地删除绘图备份,以避免破损。

  注射胚胎(仍然子宫内)是放置在无菌纱布覆母亲的腹部和潮湿温热生理盐水彻底。请注意**除膜表面的生理盐水是必不可少的,允许电流效率通过。

  GenePaddle电极,用来夹住以下的DNA注入子宫。五平方米的40 - 50V和50毫秒的电脉冲,每使用一个ECM8300 BTX电系统(图1C,C“)第二脉冲的速度交付。

  要关闭伤口,消除上腹部的纱布,并确定腹膜双方开始。开始使用黑色编织真丝线缝合腹膜。这是不建议使用此过程可吸收缝合线,因为它通常较弱,并可能导致手术后的出血和感染。最接近胸骨腹膜锚线和进行针距锚。确保所有缝线严密,没有基本的器官或皮肤已无意中进入腹膜缝。其余的缝合线剪辑并丢弃。

  拉皮肤封闭在缝合线毫米反射™皮肤缝合钉书针,夹在伤口的皮肤,小心不要主食下面的缝合线,或皮肤拉得太紧。首选的方法是保持皮肤和远离身体与钳,并在一个90度角,与主食工具。继续,直到伤口关闭(约三个订书钉)。一旦完成,确保订书钉紧轻轻按下缝合工具(图1D“)。

  监测麻醉复苏,将到她肚子里的女性,关闭异氟醚。呼吸器内饲养动物的脸,打开氧气高达3%,以帮助从麻醉中复苏。动物应被放置在一个干净的干纱布垫,以防止低温加热垫的顶部。

  氧流量下的动物几分钟,气候变暖纱布,以振奋的动物。从动物的运动短喷,应遵守,因为它返回到一个正常的呼吸模式。观察了好几分钟,直到动物似乎意识和清醒的。

  水瓶应彻底清洗,消毒,用无菌水填充。至500毫升水加2毫升磺胺二甲嘧啶抗生素(25%的股份)。

  密切监测手术后的最初24小时内的女性。如果动物的保存时间超过24小时,女性被转移到新STERILE笼子,第2天。

  新皮层是中枢神经系统,负责视觉和感觉处理和较高的认知功能的区域。它是由谷氨酸能投射神经元和GABA能interneurons,背,腹端脑,分别来自。为了满足不同的基因在新皮层发展角色,我们使用在子宫内电要么misexpress或块不同的基因的表达在背侧或腹侧端脑1,3,4(即,通过使用的shRNA结构)。 misexpress基因在胚胎的端脑,我们使用一个双顺反子表达载体(pCIG2),包含一个CMV -βactin子增强和内部核糖体进入位点(IRES),增强型绿色荧光蛋白(EGFP; pCIG2)卡带,允许转epifluorescence(图2A - C),被检测到的细胞。我们使用这项技术的引入端脑的表达结构,从E11.5到E15.5(数据显示,在E12.5,图2)。允许胚胎培养几天后,电,我们能够跟踪的绿色荧光蛋白标记的祖细胞的分化和迁移。分化收益,后3天电GFP+细胞分化和迁移脑室区(VZ),脑室下区(SVZ)和中间区(IZ),到皮质板(CP;图2C)。 ,如果在E12.5电穿孔的大脑24小时后分析,我们可以监视合作心尖祖细胞标记的标签(即,PAX6;图2A)祖细胞的成熟和神经细胞迁移的早期事件,基底祖(即Tbr2;图2B)及有丝分裂(即Tbr1新皮层神经元;图2C)。

  下丘脑位于腹面的中枢神经系统和内分泌和植物神经系统之间的网关功能的基础。在发展过程中,多个细胞核,使成熟,下丘脑区分从一个共同的祖区域,行胚胎间脑的腹侧,大部分地区。目前,祖细胞的增殖,神经细胞的分化和形成下丘脑核的分子途径,规范知之甚少。我们在子宫内的目标注入第三脑室E12 embryos.We DNA报告基因的表达,胚胎间脑的电使用,随后GFP的E14,在鉴别神经元的分布。有了这种方法,我们已经成功地有针对性的GFP表达到丘脑,前丘脑和下丘脑(图3A)。冠状切片分析表明,我们已经成功祖细胞有针对性的GFP表达,行第三脑室和神经元的脑室区迁移到地幔区域,形成原子核(图3B)

  视网膜是眼睛的神经层,负责传递给大脑的电脉冲转换成光子。它的发展胚胎间脑outpocketing,因此,从神经管是派生的。视网膜神经从根尖祖视网膜下的空间,从眼头间质细胞的分离,一腔相邻的车厢,在于发展。视网膜祖细胞针对DNA的结构,因此需要注射到一个小的目标区域。使用micromanipulators,我们已成功目标胚胎在这个狭小的地区从E13.5到E15.5(如图所示E15.5 mCherry记者PCIC electroporations;图4。)。如果电穿孔视网膜研究转染后24小时,我们观察到大多数mCherry+细胞分裂祖位于外成神经细胞层(onbl),而不是在视网膜神经节细胞层(GCL;插图形象),有丝分裂细胞本地化。

  图1。在子宫内电设置和方法论介绍(一)设置手术的关键部件包括一个Femtojet的Eppendorf微量(1),Narishige显微持针器(2),徕卡steromicroscope(3),光纤照明系统(4),830方波电穿孔系统电极(5)和加热垫(6)。 (A)的动物是使用异氟醚麻醉蒸发器的麻醉。 (B,B),简单地说,麻醉后,子宫角接触和快绿混杂的DNA注射到胚胎脑囊泡。一个成功的注射液是通过跟踪快速的绿色染料(B),可视化。 (C,C)的DNA后成功注入,桨电极置于子宫,positi两侧oning胚胎的DNA,以便将朝着正极被拉入大脑区域的选择。 (D,D),一旦所有需要的胚胎注入子宫推到腹部(四),腹膜缝合,皮肤装订(D“)。怀孕的女性,然后允许恢复所需的时间点收集的电穿孔幼仔。

  图2。代表性的例子背telencephalic电(AC)通过一个E13.5背在E12.5电穿孔与pCIG2端脑冠状切面的显微照片。电穿孔GFP+细胞分析心尖祖细胞标志物的表达(PAX6+,红色的A),基底祖(Tbr2+,红色,乙)和有丝分裂的神经元(Tbr1+,红色C )。 CP,板皮质; SVZ,脑室下区,VZ;脑室区。

  图3。间脑电击的有代表性的例子。(A)已在E12的E14,脑电穿孔与pCIG2腹面观。绿色荧光蛋白epifluorescence是在丘脑中可见,前丘脑和下丘脑,这表明在整个第三脑室的显微注射pCIG2蔓延质粒。 (二)通过电穿孔脑冠状切面的显微照片,显示迁移的GFP+脑室区和进入地幔区,将形成下丘脑核细胞。 3V,第三脑室,T,丘脑,下丘脑;海兰; MZ,地幔区;电话,端脑; PRET,prethalamus; VZ,脑室区。

  图4。视网膜电的有代表性的例子,通过电穿孔PCIC在E15.5,E16.5眼mCherry +细胞的积累外成神经细胞层的冠状切面,而不是在Brn3b +视网膜神经节细胞神经节细胞层。插图是盒装面积的高倍率图像。 GCL,视网膜神经节细胞层;乐,镜头; onbl,外成神经细胞层;重,视网膜。

  在子宫内的电,可用于分析的发育过程中的多种。例如,记者如GFP,mCherry或碱性磷酸酶基因转染可以用来进行谱系跟踪和神经细胞迁移实验。另外,Cre重组酶,可瞬时表达有选择性地消除了在一个空间和/或暂时控制方式floxed等位基因。此外,shRNA的或显性负构造可以被电击倒靶基因的功能。最后,有针对性的过表达或错误表达的关键基因在野生型和/或基因突变的鼠标线可以用来研究细胞命运的决定。这个实验的高通量是至关重要的,因为它允许许多因素的组合,在很短的时间测试。一个谨慎注意的是,此过程在细胞在基因表达的原因变化,该行针入口网站(即,在伤口上调的基因损伤反应;我们和其他13观察)。因此,建议把重点放在伤口部位以外的电穿孔细胞。此外,胚胎存活率低时,首先学习这种技术,但迅速崛起与实践 95%。迄今为止,我们已经成功地使用在子宫内电技术,以确定前神经BHLH在端脑4转录因子调节的基因。我们也验证了这一技术的使用分析telencephalic顺式调控元件3。

  作者想感谢他们最初的工作建立在子宫内电穿孔技术在CS实验室的伊娃Hadzimova,皮埃尔Mattar和Christopher Kovach。这项工作是由加拿大卫生研究院的研究所(CIHR)授予(澳门币44094)和CIHR /基金会战斗失明(FFB)新兴队格兰特(00933-000)CS和亚省儿童医院研究基金会的资助,以DMK。路是由CIHR加拿大希望奖学金的支持下,RC是一个FFB的助学金支持和领汇是在遗传学CIHR训练津贴及儿童发展的支持。